传统的MSC培养模式是2D贴壁培养，这在商业化生产中存在着一定的规模化生产局限性，特别是细胞数量要求达到109 以上时。此外2D贴壁培养中pH、DO等可控性较差，还需要频繁的传代消化以扩大制备规模，也会出现批次间差异大、频繁开口操作增加风险及质控难等问题。而3D微载体培养工艺可以有效地解决上述问题。微载体能够使贴壁依赖生长的MSC实现动态的悬浮培养，环境更为复杂，因此需要研究者调节和优化工艺参数，维持良好的细胞生长环境，促进细胞贴壁，迁移和生长。

今天K8凯发国际总结出一些实际培养过程中可供研究者优化的3D微载体培养工艺参数，希望能为大家提供有效的参考与解决办法。

图1：3D FloTrix® 间充质干细胞无血清培养基

DMEM+血清是传统的MSC培养方式，但是血清是动物源成分，可能引入病原体（如病毒、朊病毒），也存在动物伦理问题，影响临床应用的合规性，且血清批次间差异大、来源及成分不稳定，实验重复性差，很难满足生产及报药需求。无血清培养基（SFM）或成分限定培养基（CDM），无动物源成分，降低病原体风险，符合临床（如FDA/EMA）监管要求，也能够匹配收集外泌体的需求，在制备过程中减少外源外泌体的干扰。

此外，培养基筛选测试也是必不可少的，在常规进行2D培养方式筛选同时，建议同步可以使用非TC处理的培养容器（如T瓶、6孔板）、3D FloTrix® microSPIN 6通道微型生物反应器或3D FloTrix® miniSPIN FLEX 4通道生物反应器进行静态或动态的微载体培养筛选。

     图2：3D FloTrix® microSPIN 6通道微型生物反应器      图3：3D FloTrix® miniSPIN FLEX 4通道生物反应器

【微载体的推荐使用量是多少？】

图4：3D微载体溶胀

一般来说，K8凯发国际推荐的微载体培养密度为1-5g/L，而接种时可适当增加微载体密度，通过细胞贴壁后再补液调整至合适的培养密度。如载体投入量大，建议提前溶胀载体，以保证后续的接种效果。

【细胞接种量多少？】

图5：模拟细胞贴附于3D微载体

常规MSC接种密度在1-10×104细胞/mg。贴附率是决定后续细胞扩增的关键指标，接种密度过高或者过低都有可能影响细胞的贴附，从而影响后续的扩增，并造成微载体或细胞种子液的浪费，可通过优化接种梯度来评估合适细胞接种量。如有高密度灌流培养需求，可提高微载体投入量及细胞接种量并进行充分的优化实验最终评估细胞贴附率及较高的增值倍数与最终细胞量。

【转速如何设置？】

转瓶或者罐体当中以能使微载体全部悬浮起来且搅拌均匀为基准，后期细胞密度上来后，可根据微载体聚集情况微微提高转速。转速的设定值既要考虑剪切力损伤，又要考虑好的混合效果，保证细胞培养传质需求及培养环境的一致性。可以参考雷诺数Re、剪切力shear stress、最小悬浮速率Njs、K length等公式进行综合评估定性计算。

【接种时如何让细胞贴附效果更好？】

图6：细胞贴附状态

为了使细胞在微载体上有更好的贴附效果，可采用间歇搅拌—静置—搅拌的方式使MSC在最初的阶段粘附在微载体表面，必要时可以延长静置的时间，或采用低速的搅拌进行接种，以提高贴附效果。

【收获细胞阶段，裂解完仍然有“絮状物”/“颗粒物”，是否是微载体未裂解完全？】

图7：3D微载体裂解进程

在收获细胞时，使用配套的裂解液对微载体进行裂解，将3D微载体裂解为可溶性小分子和短肽。

由于MSC扩增时会分泌细胞外基质（ECM），培养过程中会出现结团的正常情况。而由于裂解液只作用于微载体，不会对细胞和细胞之间的连接（cell-cell interaction）进行消化，因此可能会出现看似聚团物（“絮状物”/ “颗粒物”）持续存在的现象。此时可适当延长裂解时间观察聚团物的变化从而判断其组成，若持续存在且不变小，则说明微载体全部裂解完全，留下的是细胞团。这些是结团的细胞可以通过后续的离心清洗来使细胞单悬，因此无需继续延长裂解时长。通过微载体残留检测试剂盒对清洗收获下来的细胞进行检测可以验证确认微载体残留情况，从而证明裂解的时长是否充分。

微载体培养MSC中有较多需要优化和注意的工艺操作点，在实际项目实践中需要一一攻破。关注K8凯发国际生物，带你解锁更多干细胞培养相关知识！

【关于K8凯发国际】

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