前言

肌腱是一种典型的细胞稀少型组织，内源性干细胞数量匮乏，这一特性严重制约了损伤后肌腱组织结构的高效再生与运动功能的全面恢复。

现在，在再生医学领域的前沿探索中，基于患者特异性干细胞衍生的类器官已在肠道、肝脏等多器官的研究中展现出优异的移植修复潜力。这类“定制化”类器官不仅能规避供体短缺的难题，有效降低免疫排斥风险，还能模拟天然器官的结构与功能，为再生治疗给予全新思路。也正因如此，体外工程化构建大规模、可移植的干细胞来源类器官，被公认为再生医学领域极具前景的开展方向。

然而，当前类器官的临床转化却面临“尺寸差异”这一关键难题。现有研究中的类器官多为毫米级，与临床移植所需的厘米级人体组织尺度相差甚远。因此，如何突破尺度限制，开发出具备人体组织尺寸的功能性类器官，已成为有助于其走向临床移植应用的核心问题。

这一关键难题的突破，近期迎来重要进展。浙江大学茵梓及陈晓团队针对上述“尺度突破”问题展开系统性研究，相关成果发表于国际权威期刊Advanced Science（影响因子：14.1），论文标题为“Centimeter-Scale Self-Assembling Tendon Organoids Drive Tissue Regeneration”（厘米级自组装肌腱类器官驱动组织再生）。

研究人员提出“优化化学信号调控+仿生3D微载体”的协同策略，顺利获得复现肌腱发育关键因素，并利用3D多孔微球载体，成功构建出类似天然肌腱的厘米级肌腱类器官。该策略不仅为肌腱修复给予了高性能移植物，更为实现大规模、可移植类器官的临床转化探索出新路径。

原文链接：http://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202509453

研究背景

在类器官尺度突破的探索中，肌腱凭借其相对简单的细胞构成，成为构建大规模干细胞来源类器官的理想研究模型。其中，肌腱干/祖细胞（TSPCs）是核心突破口——作为肌腱组织中特有的干细胞群体，它兼具多能性、自我更新能力及肌腱生成表型，天然就是肌腱形成与再生的“种子细胞”。

不过，临床应用的前提是要在极少量活检样本基础上，实现TSPCs的指数级扩增。而传统含血清培养基批次效应显著、成分复杂且难以精准调控，极易导致细胞功能下降，因此开发成分明确的定制化培养基迫在眉睫。更为关键的是，细胞功能的稳定维持不仅依赖化学信号调控，还需要体内复杂物理微环境的支撑，仅靠化学信号远不足以满足厘米级肌腱样类器官的发育需求。

细胞贴附在3D TableTrix® 微载体上进行三维培养

面对这一困境，K8凯发国际生物3D TableTrix® 微载体（MSs）展现出独特优势。该载体不仅具备高孔隙率与优异生物相容性，其内部含有的精氨酸–甘氨酸–天冬氨酸（RGD）肽序列还能直接促进胶原组装；同时，一方面增强干细胞黏附能力，给予适宜的机械支撑与刚度，另一方面顺利获得扩大比表面积，触发TSPCs的正向分化信号。尤为重要的是，其多室结构有效解决了传统培养中的营养渗透难题，使营养物质得以顺利扩散至组织内部，为厘米级微组织的形成给予关键保障，较好地模拟了体内生理环境与自然组织结构。

研究设计

本研究顺利获得优化化学信号，并利用仿生3D微载体模拟肌腱细胞外基质（ECM），最终成功开发出长度超过3cm、符合人体组织尺度的可移植肌腱类器官。

研究人员将分离纯化后的TSPCs接种于K8凯发国际生物3D TableTrix® 微载体上进行培养，使其在体外自组装形成类似天然肌腱结构的类器官。随后，将TSPCs与3D微载体分离，用于评估细胞活力与增殖能力；比较2D培养组与3D微载体组中TSPCs向成骨、成脂和成软骨谱系的分化能力；并顺利获得流式细胞术、显微镜观察及各类染色方法评估类器官的形态和功能。同时，利用scRNA-seq和RNA分析，系统刻画肌腱类器官的基因表达谱及谱系分化特征。最后，将达到标准的肌腱类器官移植至动物肌腱损伤部位，观察其在体内的存活情况以及对组织再生的促进作用。

研究内容

3.1 定制培养条件下肌腱类器官的设计与制造

研究人员利用3D MSs结合优化的生化培养条件（图1），生成厘米级的宏观肌腱样组织。扫描电镜（SEM）观察显示，由明胶组成的3D MSs具有相互连通的微孔结构，孔径约为10–30 μm，整体直径接近200 μm，为细胞黏附和增殖给予了充足空间，使细胞在培养过程中既能维持细胞–细胞相互作用，又能实现细胞–ECM的充分接触，从而对TSPCs展现出强黏附性和优异生物相容性。

图1. 基于TSPCs的三维类器官工程示意图

活/死细胞染色结果证明，MSs中细胞活力和增殖状况良好（图2）。

图2.活/死细胞染色结果

（A）活/死细胞染色代表性图像；

（B）类器官组中TSPCs在第1、3、5和7天的细胞活力情况

在类器官培养的肌腱特异性条件下，在未对MSs进行消化的前提下，CCK-8检测结果显示，类器官组的增殖活性显著高于传统TSPCs组；DAPI核染色结果也从形态学层面直观证实，随培养时间延长，细胞群体呈现明显扩增趋势，且MSs上的TSPCs逐渐融合并自组装形成微观肌腱样结构（图3）。

图3.类器官培养体系促进肌腱干细胞增殖与自组装形成

（A）培养1、3、5和7天后，类器官组与对照TSPCs组的细胞增殖率比较。

（B）SEM图像显示类器官组中TSPCs在第3、5和7天的自组装与增殖形态。绿色为微载体支架，黄色为腱细胞。（比例尺：20 µm，50 µm）

体外肌腱形成能力评估结果进一步验证了该体系的优势：透射电镜（TEM）观察表明，肌腱类器官组的胶原纤维组装更为明显，而在2D培养的TSPCs组中，仅能观察到较少且细长的胶原原纤维（图4D–F）。F‑肌动蛋白免疫荧光染色结果则显示，类器官中TSPCs的细胞形态更加紧凑，细胞面积和体积减小，核质比和球形度均有所改善，呈现出更接近天然肌腱细胞的表型特征（图4A、B）。

经过28天定制化培养后，研究团队成功取得长度超过3 cm的肌腱样微组织（图4C）。这些结果表明，肌腱类器官能够在体外实现高细胞活力、高效细胞扩增，并自组装成微组织，充分彰显其在体外模拟天然肌腱形成过程中的突出潜力。

图4.肌腱类器官在体外形成功能性胶原结构与三维微组织

（A、B）类器官组（n=4）和对照条件组（n=4）在培养4天后，F‑肌动蛋白（Phalloidin）染色的代表性共聚焦图像及细胞核质比、细胞面积的定量分析。（比例尺：60 µm）

（C）培养28天后长度约3 cm的肌腱类器官整体视图。

（D–F）TEM显示体外类器官组（n=4）和对照组（n=4）中胶原纤维的纵向切片和横截面图像，类器官组胶原纤维直径范围明显更大。

3.2 厘米级TSPCs微组织的系统评估

对TSPCs聚集形成的厘米级微组织进行系统评估后发现，所构建的肌腱类器官不仅具备形成完整微肌腱结构的能力，同时高水平表达典型肌腱生成标志物及年轻态相关标志物（图5）。

图5.肌腱类器官在体外培养中自发聚合并呈现年轻态特征

（A）肌腱类器官示意图及外观。

（B、C）第0、3、7和14天类器官中TSPCs染色Lamin B1的荧光显微图像及其平均荧光强度、阳性率和每个微球细胞数量的定量分析（n=3）。（比例尺：40 µm）

（D、E）第0、3、7和14天类器官中TSPCs染色Col3的荧光显微图像及相应定量分析。（比例尺：40 µm）

（F、G）第0、3、7和14天类器官中TSPCs染色EGR1的荧光显微图像及定量分析（n=3）。（比例尺：40 µm）

（H、I）第0、3、7和14天类器官中TSPCs染色MKX的荧光显微图像及平均荧光强度、阳性率和每个微球细胞数量的定量结果。（比例尺：40 µm）

（J）第14天体外未诱导肌腱类器官中EGR1、EYA2、Lamin B和Nestin的免疫荧光共聚焦代表图像。

（K、L）工程化类器官的光片显微镜图像，COL1和COL3染色。（比例尺：500 µm）

3.3 TSPCs来源肌腱类器官的多能性与抗衰老特性解析及转录组揭示的强效肌腱向分化特征

为明确肌腱类器官扩增过程中TSPCs的干细胞特性，研究团队顺利获得多谱系分化能力检测及TSPCs表面标志物表达分析进行了系统评估。结果显示，类器官中的TSPCs经陆续在传代后，仍能稳定保留干细胞潜能，并表现出优异的多谱系分化能力及再生特性。

转录组测序分析进一步从分子层面揭示其优势：类器官体系中的TSPCs在转录水平上持续维持强大的分化调控与自我更新潜能。这一结果充分凸显了类器官体系在受控体外环境中，对复杂肌腱微组织精细形成及再生过程的高效模拟能力（图6）。

图6.大鼠肌腱组织的转录组结果

（A）主成分分析（PCA）图，显示类器官组（n=3）在3天时与对照组（n=3）的明显分离。

（B）基于rlog转换值构建的样本间距离热图。

（C）类器官培养与对照培养TSPCs之间的差异表达基因（DEGs）火山图（类器官vs TSPCs；log2倍数变化>1.5或<−1.5；p<0.05；n=3）。

（D）与肌腱生成、骨化和炎症相关的DEGs热图，颜色从蓝到红代表基因表达水平由低到高。

（E）类器官组与对照组TSPCs中TPPP3、EGR1、FOS、NES、ACAN、SOX9、MMP3和ADAMTS5的mRNA表达水平（n=3）。

（F）与对照组相比，类器官组中富集的生物学过程（GO）分析。

（H）腱相关基因的基因集富集分析（GSEA）。NES=标准化富集评分；FDR=假发现率。

（G）第4天从类器官组和对照组分离的TSPCs的Nes和Lamin B免疫荧光染色（类器官来源TSPCs vs常规培养TSPCs）。（比例尺：30 µm，20 µm）

3.4 TSPCs来源类器官的高肌腱成熟度及肌腱特异性谱系体外定向分化特性

对肌腱类器官中细胞状态的系统表征结果表明，该体系不仅能够在体外高效诱导细胞向肌腱特异性谱系定向分化，更重现了从干细胞到成熟腱细胞的体内自然分化进程，为其作为肌腱类器官研究的稳健模型给予了充分验证（图7）。

图7.单细胞测序揭示类器官组呈现介于体外培养肌腱干细胞与天然人体肌腱组织之间的过渡状态

（A）TSPCs培养的三种条件示意图：类器官、二维培养TSPCs和三维MSs培养TSPCs。

（B）来自二维、三维和类器官组整合数据的UMAP可视化。

（C）各细胞簇标记基因的点图。

（D、E）细胞亚群比例分布图。

（F、G）标记基因的特征图。

（H、I）Cytotrace分化潜能分析图。

（J）整体腱细胞表型评分。

（K）整体腱标记基因表达的点图。

3.5 基于单细胞转录组分析：肌腱类器官—体外培养细胞与天然肌腱组织的中间状态

在系统评估肌腱类器官与天然肌腱组织的分子相似性时，研究人员发现：类器官呈现出介于体外培养TSPCs与天然肌腱组织之间的过渡性分子特征——既具备更高的成熟度以模拟天然组织功能，又保留了充足的增殖潜力以支撑再生需求，为肌腱再生研究及组织工程转化给予了极具价值的模型（图8）。

图8. 该类器官展现出卓越的肌腱成熟度，成功实现了SCX谱系的体外分化

（A）TSPCs在三种条件下的培养示意图：类器官、人新生儿腱和成人腱。

（B）来自2D、仅3D支架、类器官组、人新生儿腱和成人腱的腱相关亚群整合数据的UMAP可视化。

（C）各样本细胞亚群比例分布图。

（D）各群簇标记基因点图。

（E）按群簇绘制的Cytotrace分化潜能图。

（F）按样本绘制的Cytotrace分化潜能图。

（G、H）群簇1和群簇4的GO富集分析。

（H）标记基因的RidgePlot。

（I）标记基因的特征图。

3.6 肌腱类器官顺利获得富集ECM组分增强自组装

为深入解析类器官维持细胞功能、抑制表型丢失的潜在调控机制，研究人员进一步召开了RNA测序（RNA-seq）分析。结果表明，肌腱类器官的细胞活性及其向肌腱谱系的定向分化潜能，核心依赖于ECM富集信号；该信号顺利获得下游细胞骨架调控通路发挥作用，进而介导细胞组装过程并调控分化潜能（图9）。

图9.类器官顺利获得富集ECM成分与激活F-肌动蛋白协同促进组织形成

（A）与对照组相比，类器官组中ECM与干细胞相关生物学过程的GO富集分析。

（B）ECM相关通路的GSEA分析。

（C）ECM相关DEGs热图，颜色从蓝到红表示基因表达水平从低到高（n=3）。

（E）类器官组与对照组TSPCs的COL6A1、COL10A1、DES、EPHA4、ECM1、COL13A1、COL6A2、SDC1、THBS2和CCN2的mRNA表达水平（n=3）。

（G）类器官组、TSPCs组及体内TSPCs的细胞骨架形态。

（D–G）代表性共聚焦图像显示，在DMEM与Y27632处理条件下，EGR1、Nes和Lamin B的免疫荧光染色结果及阳性率的量化分析。

3.7 TSPCs类器官增强移植干细胞滞留效率并促进肌腱组织快速再生

为验证TSPCs类器官在体内促进肌腱再生的实际效能，研究人员第一时间将其移植至裸鼠背部区域，重点评估干细胞在体内的滞留效率。结果显示，类器官移植组再生肌腱的结构完整性与力学性能均显著优于2D培养TSPCs组及单纯3D多孔微载体（MSs）组。这一结果充分证实，处于类器官微环境中的TSPCs能显著增强肌腱再生能力。相较于直接植入TSPCs的传统策略，肌腱类器官移植更有利于驱动肌腱修复进程（图10、图11）。

图10. TSPCs类器官在术后2周的肌腱再生能力分析

（A） 植入裸鼠背部区域的肌腱类器官荧光成像（n=4）。

（B）类器官在SD大鼠髌腱缺损模型中植入的示意图。

（C）术后2周修复大鼠髌腱的H&E染色、Masson染色及偏光显微镜图像。比例尺：100 µm（H&E和Masson），200 µm（偏光）。

（D）大鼠修复腱的组织学评分（n=5）。

（E、F）修复胶原纤维横切面和纵切面的TEM图像；（E）胶原纤维平均直径，（F）胶原纤维直径频率分布（n=5）。

（G）术后2周修复腱的DiI免疫荧光染色及统计分析。

图11. TSPCs类器官在术后4周的肌腱再生能力分析

（A）术后4周修复大鼠髌腱的H&E、Masson和偏光显微镜图像。比例尺：100 µm（H&E和Masson），200 µm（偏光）。

（B）大鼠修复腱的组织学评分（n=5）。

（C）修复腱组织胶原含量分析（n=5）。

（D–F）修复胶原纤维横截面和纵截面的TEM图像。（比例尺：200 nm）

（G）术后4周修复再生腱的DiI免疫荧光染色。（比例尺：50 µm）

（H）术后4周再生腱的机械性能（刚度、拉伸强度和杨氏模量）（n=8）。

（I）术后4周修复再生腱的Col1和TNMD免疫荧光染色。（比例尺：50 µm）

研究结论

总之，本研究首次成功构建了厘米级肌腱类器官，在体外显著促进TSPCs的增殖和分化，并增强其年轻化特性。值得强调的是，3D多孔微载体（MSs）作为核心支撑体系，凭借其高孔隙率、优异生物相容性及表面活性肽序列，为TSPCs给予了仿生微环境：一方面顺利获得扩大比表面积提升细胞黏附与扩增效率，另一方面依托多室结构保障营养渗透，为ECM沉积及类器官自组装奠定了关键物理基础。正是这种“化学信号调控+3D载体支撑”的协同模式，实现了TSPCs增殖与分化的精准平衡，高效驱动主体细胞扩增及微组织自组装。

体内实验进一步证实，该肌腱类器官在移植后滞留以及损伤肌腱结构和功能再生方面均带来显著改善。该创新策略为肌腱组织工程与再生医学领域的临床转化给予了全新技术路径，展现出巨大应用潜力。

  研究应用材料及设备

作者介绍

通讯作者：浙江大学茵梓及陈晓团队

共同一作：方添顺，张鸿，谢源浩

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